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美吉生物助力客戶登陸《柳葉刀》

項目文章2016-10-20 17:53

  華南農業大學劉健華教授團隊和中國農業大學徐沈建忠教授團隊合作在國際權威醫學期刊《柳葉刀》子刊《柳葉刀·傳染病》(Lancet Infect Dis,IF:22)上發表題為 “Emergence of plasmid-mediated  colistin  resistance  mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and   molecular biological study”的研究文章,相關測序工作由美吉生物攜手完成。

研究背景

  迄今為止,已發現的多粘菌素耐藥性都與細菌基因組的突變有關,未報道其與可移動遺傳元件有關。在我國開展的一項食用肉畜中共生大腸桿菌的耐藥性常規監測項目中發現,細菌對多粘菌素的抗性顯著增加。研究人員發現豬體內分離的大腸桿菌SHP45,其多粘菌素耐藥性可以傳遞給其它菌株,通過對該菌株的質粒測序首次發現了質粒介導的MCR-1多粘菌素抗性機理。

研究方法

  通過全質粒測序和亞克隆發現MCR-1基因;利用序列比對、同源建模和電離質譜對MCR-1的分子機理進行了分析和研究;對2011年4月至2014年11月收集的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的MCR-1基因進行了分子流行病學調查;用小鼠模型研究了MCR-1與多粘菌素的耐藥機理。

分析內容

  pHNSHP45轉移機制研究和藥物敏感性試驗

對pHNSHP45質粒的轉移機制研究發現,它可以通過接合機制,以10-1-10-3的轉移率轉移進其他大腸桿菌中。pHNSHP45能通過轉化(不能接合)進入大腸桿菌E11(ST131),肺炎克雷伯菌MPC11,肺炎克雷伯1202(ST11)和銅綠假單胞菌FE26,表現出高達8-16倍的最小抑制濃度。大腸桿菌W3110轉導子質粒pUC18-MCR-1包含一段1949bp的pHNSHP45序列片段,也表現出高達四倍的最小抑制濃度。這些表明MCR-1存在使宿主菌種產生了多菌素抗性。

質粒測序與質粒介導的多粘菌素抗性因子證實

  對質粒pHNSHP45測序得到其基因組小大為64015bp,GC含量43%,預測到60個基因。屬于典型的IncI2型質粒。其中在一個IS序列的下游區域,發現有一個1626bp的ORF,命名為MCR-1,GC含量為49%(圖1)。



圖1 質粒pHNSHP45圈圖

  將mcr-1基因克隆到pUC18質粒,用其轉化大腸桿菌W3110發現,W3110對多粘菌素產生抗性。隨后對MCR-1基因在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌中的存在情況進行了檢測,選取從2011年4月份到2014年11月份之間,來自我國五個不同省份的檢測樣本,發現從動物體內以及市場上零售的肉類食品中分離出的大腸桿菌樣本有高比例的MCR-1基因存在(表1)。

表1 多菌素抗性基因MCR-1流行情況



同源蛋白建模分析

  對MCR-1蛋白質序列的初步分析發現在其N端的200個氨基酸序列具有五個親水性跨膜α螺旋。蛋白質同源建模發現兩個已知蛋白結構的磷酸乙醇胺轉移酶(LptA:源于腦膜炎奈瑟氏球菌;EptC:源于空腸彎曲菌)的可溶性部分與MCR-1有同源性。建模結果顯示其N端結構與LptA、EptC其中之一吻合,C端折疊與兩者高度吻合。序列對比分析發現MCR-1具有在LptA和EptC中起催化活性的關鍵殘基。因此,MCR-1的序列和結構預測證明其是一個膜錨定的具有磷酸乙醇胺轉移酶活性的蛋白。



                     圖2 MCR-1的N末端結構與同源建模

MCR-1對多粘菌素抗性的活體分析

  將含有MCR-1基因的大腸桿菌363R與消除MCR-1的363S分別導入小鼠模型,結果發現在106菌落單位中,72小時內363S的傳遞至少減少三個數量級,而363R僅減少一個數量級。這表明在體內MCR-1的存在能夠使細菌產生多粘菌素抗性。



                       圖3 體內感染實驗

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